SEXREVERSAL

Sex reversal merupakan cara pembalikan arah perkembangan kelamin ikan yang seharusnya berkelamin jantan diarahkan perkembangan gonadnya menjadi betina atau sebaliknya. Teknik ini dilakukan pada saat belum terdiferensiasinya gonad ikan secara jelas antara jantang dan betina pada waktu menetas. Sex reversal merubah fenotif ikan tetapi tidak merubah genotifnya teknik sex reversal mulai dikenal pada tahun 1937 ketika estradiol 17 disintesis untuk pertama kalinya di Amerika Serikat. Pada mulanya teknik ini diterapkan pada ikan guppy (Poeciliareticulata). Kemudian dikembangkan oleh Yamamato di Jepang pada ikan medaka (Oryzias latipes). Ikan medaka betina yang diberi metiltestosteron akan berubah menjadi jantan. Setelah melalui berbagai penelitian teknik ini menyebar keberbagai negara lain dan diterapkan pada berbagai jenis ikan. Awalnya dinyakini bahwa saat yang baik untuk melakukan sex reversal adalah beberapa hari sebelum menetas (gonad belum didiferensiasikan). Teori ini pun berkembang karena adanya fakta yang menunjukkan bahwa sex reversal dapat diterapkan melalui embrio dan induk yang sedang bunting. Penerapan sex reversal dapat menghasilkan populasi monosex (kelamin tunggal). Kegiatan budidaya secara monosex (monoculture) akan bermanfaat dalam mempercepat pertumbuhan ikan hal ini dikarenakan adanya perbedaan tingkat pertumbuhan antara ikan berjenis jantan dengan betina. Beberapa ikan yang berjenis jantan dapat tumbuh lebih cepat daripada jenis betina misalkan ikan nila dan ikan lele Amerika. Untuk mencegah pemijahan liar dapat dilakukan melalui teknik ini. Pemijahan liar yang tidak terkontrol dapat menyebabkan kolam cepat penuh dengan berbagai ukuran ikan total biomass ikan tinggi namun kualitasnya rendah pemeliharaan ikan monoseks akan mencegah perkawinan dan pemijahan liar sehingga kolam tidak cepat dipenuhi ikan. Selain itu ikan yang dihasilkan akan berukuran besar dan seragam contoh ikan yang cepat berkembangbiak yaitu ikan nila dan mujair. Pada beberapa jenis ikan hias seperti cupang, guppy, kongo dan rainbow akan memiliki penampilan tubuh yang lebih baik pada jantan daripada ikan betina dengan demikian nilai jual ikan jantan lebih tinggi ketimbang ikan betina.
Sex reversal juga dapat dimanfaatkan untuk teknik pemurnian ras ikan telah lama diketahui ikan dapat dimurnikan dengan teknik ginogenesis yang produknya adalah semua betina. Menjelang diferensiasi gonad sebagian dari populasi betina tersebut diambil dan diberi hormon androgen berupa metiltestosteron sehingga menjadi ikan jantan. Selanjutnya ikan ini dikawinkan dengan saudaranya dan diulangi beberapa kali sampai diperoleh ikan dengan ras murni.
Metode sexreversal:
1. Hormon Steroid
         Salah satu teknik reversal adalah dengan memberikan hormon steroid pada fase labil kelamin. Pada beberapa spesies iakn teleost gonochoristic, fisiologo kelamin dapat dengan mudah dimanipulasi melalui pemberian hormone steroid.(piferrer et al. 1994). Nagy et al. (1981) menjelaskan bahwa keberhasilan manipulasi kelamin pada ikan menggunakan hormn dipengaruhi oleh beberapa factor antara lain : jenis dan umur ikan, dosis hormon, lama waktu, dan cara pemberian hormon serta lingkungan tempat pemberian hormon dilakukan. Ditekankan oleh Hunter dan Donaldson (1983), bahwa keberhasilan pemberian hormone sangat tergantung pada interval waktu perkembangan gonad, yaitu pada saat gonad dalam keadaan labil sehingga mudah dipengaruhi oleh hormon. Hrmon steroid yang dihasilkan oleh jaringan steroidogenik pada gonad terdiri atas hormone androgen untuk maskulinasi, esterogen untuk feminisasi dan progestin yang berhubungan dengan proses kehamilan (Hadley 1992).Namun pada tahap perkembangan gonad belum terdeferensiasi menjadi jantan atau betina, hormone steroid belum terbentuk sehingga pembentukan gonad dapat diarahkan dengan menggunakan hormone steroid sintetik (Hunter & Donaldson 1983).Salah satu jenis hrmon steroid sintetik yang banyak digunakan untuk proses sex reversal pada ikan (khususnya ikan nila) adalah hormon 17a-methyltestosterone(mt).Hormon 17a-methyltestosterone(mt) merupakan hormone androgen yang bersifat stabil dan mudah  dalam penanganan (Yamazaki 1983). Pemberiannya dapat dilakukan secara oral (Misnawati 1997), perendaman embrio alevin maupun larva (Laining 1995) maupun implantasi dan injeksi (Mirza & Shelton 1988).
2.  Aromatase dan Aromatase Inhibitor
           Selain dengan hormn steroid, diferensiasi kelamin juga dipengaruhi oleh ekspresi dari gen yang menghasilkan enzim aromatase (Patino 1997). Aromatase adalah enzim cytochrome P-450 yang mengkatalis perubahan dari androgen menjadi esterogen. Aktivitas enzim aromatase terbatas pada daerah dengan target estradiol dan berfungsi untuk mengatur jenis kelamin, reproduksi dan tingah laku (Callard et al. 1990). Ada 2 bentuk gen aromatsae pada ikan yaitu : aromatase otak dan armatase ovari. Aromatase ota berperan sebagai pengatur perilaku sex spesifik pada mamalia dan burung (Schlinger & Callard 1990, diacu dalam Melo & Ramsdell 2001) dan juga mengatur reproduksi pada ikan (Pasmanik et al. 1988, diacu dalam Melo & Ramsdell 2001).Aktivitas enzim aromatase pada otak teleostei 100-1000 kali lebih tinggi disbanding pada mamalia. Aktivitas enzim aromatase ovary kurang dari 1/10 kali aktivitas enzim aromatase otak. Fungsi cytocrome P-450 pada determinasi jenis kelamin telah teruji Karen merupakan enzim yang bertanggung jawab dalam proses aromatisasi dari androstenedinione menjadi estrone atau testosterone menjadi estradiol 17ß. Aktivitas enzim aromatase berkorelasi dengan struktur gonad, yaitu larva dengan aktivitas aromatase rendah akan mengarah pada terbentuknya testis, sedangkan aktivitas aromatase yang tinggi akan mengarah pada terbentuknya ovary.
Aromatase inhibitor berfungsi untuk menghambat kerja enzim aromatase dalam sintesis estrogen. Adanya penghambatan ini mengakibatkan terjadinya penurunan konsentrasi estrogen yang mengarah kepada tidak aktifnya transkripsi gen aromatasenya sebagai feedbacknya (Server et al. 1999). Penurunan rasio estrogen terhadap androgen menyebabkan terjadinya perubahan penampakan dari betina menjadi menyerupai jantan (terjadi maskulinasi karakteristik seksual sekunder). Secara umum, aromatase inhibitor menghambat aktivitas enzim melalui 2 cara, yaitu dengan menghambat proses transkripsi gen aromatase sehingga mRNA tidak terbentuk dan sebagai konsekuensinya enzim aromatase tidak ada (Server et al 1999). Cara kedua adalah melalui cara bersaing dengan substrat selain testosterone sehingga aktivitas enzim aromatase tidak berjalan (Brodie 1991).
3. Methyl Testosterone (MT)
Hormon androgen yang paling umum yang digunakan dalam aplikasi sex reversal untuk maskulinisasi (pengarahan kelamin menjadi jantan) adalah 17α-methyltestosterone yang diperkirakan efektif digunakan pada lebih dari 25 spesies yang telah diuji. Methyl testosterone merupakan androgen yang paling sering dipakai untuk merubah jenis kelamin dan penggunaan metiltestosteron pada dosis yang berbeda akan memberikan pengaruh yang berbeda pula. 17α-methyltestosterone (17α-MT) merupakan hormon sistetik yang molekulnya sudah dimodifikasi agar tahan lama di dalam tubuh. Hal ini dikarenakan pada karbon ke-17 telah ditempeli gugus metal agar tahan lama (Junior, 2002). Methyl testosterone dibuat dengan cara menambahkan satu kelompok α-metil pada atom karbon ke-17 di dalam gugus testosteron dengan rumus bangun kimia kimia C20H30O2, berbobot molekul 302,05.
Penggunaan 17α-methyltestosterone saat ini sudah mulai dikurangi. Hal ini dikarenakan diduga sifat 17α-metiltestosteron yang dapat menimbulkan pencemaran karena sulit terdegradasi, dan karena 17α-metiltestosteron dapat menyebabkan kanker pada manusia. Contreras – Sanchez et. al (2001) menyatakan bahwa residu anabolik 17α-methyltestosterone masih tertinggal pada sedimen kolam setelah tiga bulan penggunaan pada maskulinisasi benih ikan nila. Residu ini dikhawatirkan dapat menimbulkan ekspos yang tidak diharapkan pada pekerja, ikan dan organisme lain. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa pemberian hormon 17α-methyltestosterone mampu mempengaruhi perkembangan gonad beberapa ikan.
Percobaan pada diferensiasi seks lingkungan (ESD) di Atlantik Halibut melalui suhu pemeliharaan terkendali yang menunjukkan hasil yang samar-samar; Meskipun satu studi menunjukkan bahwa suhu tinggi terpengaruh ekspresi sitokrom P450 aromatase gen (cyp19a) (van SPN dan Andersen, 2006), hasil dari pekerjaan yang lebih baru menunjukkan bahwa suhu pemeliharaan tidak mempengaruhi rasio jenis kelamin (Hughes et al., 2008). Penggunaan steroid hormon yang efektif untuk seks disebabkan pembalikan (Hendry et al., 2003), tetapi sementara steroid disetujui untuk digunakan dalam pertanian di beberapa negara, mereka dapat menyebabkan masalah dengan konsumen persepsi di bagian lain dunia. Penggunaan non-steroid agen untuk seks pembalikan dapat memberikan wawasan lebih lanjut tentang mekanisme yang mengontrol diferensiasi seks, serta menyediakan alternatif untuk pengobatan steroid.
Aromatase Inhibitor (AI) telah banyak digunakan dalam terapi kanker payudara. sejak selektif inhibisi produksi estrogen telah ditemukan untuk menjadi strategi yang efektif untuk pengobatan kanker payudara, sejumlah AI telah dikembangkan. Mereka dapat classi berdasarkan struktur kimia yang mereka sebagai steroid (tipe I) dan non steroid (tipe II). Fadrozole (afema) adalah sebuah kompetitif, tipe II aromatase inhibitor. Tindakan didasarkan pada noncovalent reversibel interaksi dengan heme bagian dari aromatase dan pekerjaan yang substrate binding situs (miller et al., 2008). Fadrozole itu dibuktikan menyebabkan lengkap pembalikan seks betina ke genetik fenotipik laki-laki di nil ikan nila, Oreochromis niloticus (kobayashi et al., 2003; kwon et al., 2000), ikan zebra Danio rerio (uchida et al., 2004), dan flounder jepang, Paralichthys olivaceus (Kitano et al., 2000).
Menurut Mukti (2002), kelebihan dosis hormon metiltestosteron yang diberikan pada ikan dapat mengurangi jumlah kelamin jantan yaitu hormon metiltestosteron semakin memacu perkembangan kelamin atau gonad betina ikan (bukan kelamin jantan). Semakin tinggi dosis hormon yang diberikan dapat menurunkan tingkat kelulushidupan ikan, karena adanya sifat racun (toxit) dari hormon kepada ikan.
Pemberian hormon metiltestosteron pada benih ikan gurami tidak menyebabkan perubahan genetik ikan, karena hormon ini hanya akan mencapai dan mempengaruhi organ target saja dan bukan kelamin ikan, differensiasi kelamin atas pengaruh pemberian hormon mengubah fenotip kelamin, tetapi tidak mengubah genotipnya (Zairin, 2002). Efektifitas pembentukan kelamin jantan sangat ditentukan oleh ketepatan pemberian dosis hormon metiltestosteron dan umur ikan sebelum gonad terdifferensiasi, karena dosis dan masa differensiasi yang tepat akan menghambat pembentukan ovari dan sebaliknya pembentukan gonad jantan semakin cepat, sehingga gonad akan berkembang menjadi testis (Sunandar, 2006).
Pematang gonad ikan yang bekerja dibawah kendali hormon-hormon, secara umum mekanisme terjadi secara alamiah dan rekayasa (rangsangan). Mekanisme secara alamiah kerja hormon untuk perkembangan dan pematangan gonad dimulai dari adanya rangsangan dari luar seperti visual untuk fotoperiode, kemoreseptor untuk suhu dan metabolit yang kemudian diterima oleh susunan saraf otak melalui reseptor-reseptor penerima rangsangan susunan saraf otak kemudian merangsang hipotalamus untuk melepaskan Gonadropin Releasing Hormon (GnRH) untuk mestimulasi kelenjar hipofisa (pituitary) untuk mengsekresikan Gonadotropin Hormon (GtH) kemudian dialirkan ke dalam darah untuk merangsang kematangan gonad akhir melalui simulasi untuk mensintesis hormon-hormon steroid pematangan (seperti hormon testoteron dan estradiol) dalam ovarium atau testis, dan mempengaruhi perkembangan kelamin sekunder (Sunandar, 2006).
Mekanisme rangsangan pembentukan gonad jantan dengan menggunakan hormon metiltestosteron (hormon steroid) dimulai dari penyepan hormon kedalam tubuh ikan secara difusi dan disekresikan melalui saluran darah (Montgomery, et all., 1983). Proses bagaimana hormon steroid tersebut dapat merangsang pemasakan oosit maupun sperma mekanismenya belum diketahui, tetapi diduga melalui tranfer kode terjemahan RNA (Darwisito, 2002).
Gangguan endokrin didefinisikan sebagai gangguan perkembangan gonad, baik adanya perubahan pada pembentukan duktus atau adanya perkembangan ovotestis yang mengarah pada feminisasi (Liney, et al., 2005) atau adanya rangsangan munculnya karakter kelamin sekunder jantan yang mengarah pada maskulinisasi (Larsson, et al., 2006). Sedangkan menurut WHO/IPCS dalam Falcorner, et al. (2006) endocrine-disrupting compounds didefinisikan sebagai substansi eksogenus yang mengubah fungsi sistem endokrin yang menimbulkan konsekuensi pengaruh kesehatan yang kurang baik terhadap organisme, atau keturunannya, atau (sub)-populasi yang menerimanya. Gangguan ini dapat terjadi akibat adanya substansi kimia di perairan yang mengganggu sistem endokrin pada organisme ikan. Umumnya, substansi kimia, baik bersifat alami ataupun sintesis yang dikenal sebagai endocrine disrupter, memiliki kemampuan untuk berikatan dengan estrogen reseptor (Brian, et al., 2005) atau androgen reseptor (Larsson, et al., 2006) bergantung pada mekanismenya. Gangguan yang ditimbulkan juga bervariasi bergantung tipe bahan dan organisme yang dipengaruhinya. Gangguan dapat terjadi dengan berbagai jalan karena ikan yang hidup di perairan terbuka bukan hanya terpapar pada subtansi tunggal melainkan dapat terpapar pada substansi kompleks dengan jumlah bervariasi sehingga dapat menimbulkan pengaruh kombinasi baik dengan mekanisme yang tunggal/sama ataupun berbeda (8085).
Beberapa substansi kimiawi yang terdeteksi berada di lingkungan perairan dapat berpengaruh terhadap sistem endokrin organisme. Substansi yang dapat menggangu sistem endokrin (EDS, endocrine disrupting substance) tersebut diantaranya estrogen alami (17b-estradiol dan estron) dan estrogen sintetis (17a-ethynil estradiol) (Kavanagh, et al., 2004). Gangguan sistem endokrin yang dapat terjadi adalah adanya mekanisme “feminisasi” pada ikan jantan yaitu perubahan pada perkembangan duktus gonad, baik pembentukan rongga ovari seperti betina dan/atau keberadaan sel germ jantan dan betina pada gonad yang sama, peningkatan konsentrasi vitellogenin, perubahan pada perkembangan ginjal, gangguan fungsi imun dan menyebabkan kerusakan genotoksik (Liney, et al., 2005).
Adanya phenomena tersebut disinyalir akibat degradasi yang tidak lengkap pada sistem instalasi pengolahan air limbah, seperti yang dilaporkan terjadi di sungai-sungai di Eropa, Jepang dan Amerika (Liney, et al., 2005). Pengaruh substansi estrogenik teramati pada beberapa ikan liar yang mengalami perkembangan interseks yang tidak biasa seperti pada ikan roach (Rutilus rutilus), gudgeon (Gobio gobio), barbel (Barbus plebejus), shovelnose sturgeon (Scaphirhynchus platyorynchus), European flounder (Platichthyes flesus) dan Japanese flounders (Pleuronectes yokohamae) (Jobling, et al., 2002).
Menurut Sumpter dan Johnson (2005), 17b-estradiol (E2) dan 17a-ethynil estradiol (EE2) merupakan dua substansi yang paling poten yang dapat menyebabkan gangguan sistem endokrin. Potensi nyata EE2 dapat mencapai 20 kali lipat dibandingkan E2. Pada konsentrasi nanogram per mililiter EE2 telah dapat berpengaruh terhadap ikan. Penelitian di Belanda menunjukkan EE2 ditemukan pada konsentrasi <0.3 – 5.9 ng/L di limbah perkotaan dan <0.3 – 3.9 ng/L di limbah industri. Ekspose ikan rainbow (Oncorhynchus mykiss) jantan dewasa pada limbah perkotaan tersebut selama 12 – 17 hari telah menyebabkan adanya peningkatan konsentrasi vitellogenin plasma darah (Vethaak, et al., 2005). Sedangkan pada ikan zebrafish (Danio rerio), ekspose ikan sejak fertilisasi hingga mencapai tahap reproduksi (umur 118 hari) pada EE2 3 ng/L dapat menyebabkan 100% individu menjadi betina (Fenske, et al., 2005).
Di Indonesia, sejauh ini belum ditemukan adanya laporan mengenai pengaruh limbah perkotaan terhadap gangguan endokrin pada ikan liar yang hidup di perairan umum. Potensi adanya gangguan tersebut akan lebih besar di sungai-sungai yang menerima limbah industri yang sangat tinggi, seperti Sungai Citarum, Jawa Barat. Secara laboratoris, potensi gangguan tersebut dapat diamati dengan ekspose ikan-ikan liar, misalnya ikan nilem, pada substansi yang mungkin dapat ditemukan di perairan umum, salah satunya ethynil estradiol.
Dari hasil pengamatan kepadatan sperma ikan nilem pada beberapa perlakuan injeksi EE2 belum dapat diindikasikan adanya perubahan kemampuan spermiasis ikan nilem. Hal ini diduga akibat terlalu pendeknya selang waktu injeksi dengan pengamatan spermiasis. Selain itu, sensitifitas terhadap estrogen juga bersifat spesifik-spesies (Vethaak, et al., 2005) sehingga dapat terjadi EE2 tidak berpengaruh terhadap ikan nilem. Kondisi seperti itu dilaporkan pada ikan roach yang sebelumnya tidak terekspose limbah kemudian setelah dewasa diekspose pada limbah dan ternyata tidak teramati adanya gangguan pada duktus reproduksinya (Liney, et al., 2005). Namun, perubahan mungkin terjadi bila dapat diamati pada level vitellogenin plasma darah seperti yang teramati pada ikan rainbow trout yang diekspose limbah pada selang waktu yang relatif pendek (selama 12 – 17 hari) dimana konsentrasi vitellogeninnya meningkat hampir dua kali lipat (Vethaak, et al., 2005).
Hampir semua penelitian mengenai gangguan endokrin dilaporkan berkaitan dengan efek estrogenik yang menimbulkan gejala feminisasi pada ikan akibat buangan dari pengolahan air limbah perkotaan/industri dan efek androgenik yang menimbulkan gejala maskulinisasi akibat buangan air limbah pengolahan kayu.
4. Efek Estrogenik
Penelitian mengenai adanya feminisasi pada ikan liar di perairan tawar dan estuari telah banyak dilaporkan di Inggris dan beberapa negara Eropa, Jepang dan Amerika Serikat. Laporan awal yang paling ekstensif mengenai feminisasi akibat pengaruh air limbah dilakukan Jobling dan koleganya pada tahun 1998 pada ikan roach (Rutilus rutilus) di >50 titik sungai di Inggris (Liney, et al., 2005) dan Guillette dan koleganya pada tahun 2000 yang telah menemukan adanya pengaruh tersebut pada alligator di beberapa danau di Florida (Sumpter, 2005). Gangguan endokrin yang muncul tersebut berkaitan dengan ekspose ikan pada buangan dari instalasi pengolahan air limbah industri dan domestik. Kebanyakan laporan mengenai pengaruh feminisasi dari air limbah pada ikan adalah adanya induksi pada vitellogenin, perubahan tingkat hormon steroid seks pada ikan juvenil dan ikan dewasa, kelemahan pada perkembangan gonad, perubahan waktu diferensiasi seks dan interseks pada gonad (Liney, et al., 2005).
Interseks pada gonad ditandai dengan adanya jaringan testikular dan ovari pada gonad yang sama (Kavanagh, et al., 2004) dan/atau adanya gangguan pada duktus gonad dimana duktus jantan mengalami feminisasi membentuk rongga ovari seperi betina (Gambar 1) (Liney, et al., 2005). Meskipun interseks secara alami biasa terjadi pada spesies ikan protaginus dan protandri, namun pada ikan gonokoristik fenomena ini merupakan gejala tidak normal dan biasanya hanya ditemukan pada ikan yang sengaja diekspose terhadap hormon steroid atau aromatase inhibitor (Jobling, et al., 2002). Pemeliharaan kembali ikan yang mengalami gangguan seksual setelah ekspose pada air limbah menunjukkan bahwa feminisasi pada duktus reproduksi bersifat permanen (Liney, et al., 2005).
Spesies ikan air tawar liar yang menampakkan adanya kejadian interseks yang tidak biasa telah dilaporkan pada ikan roach (Rutilus rutilus), gudgeon (Gobio gobio), barbel (Barbus plebejus), dan shovelnose sturgeon (Scaphirhynchus platyorynchus), sedangkan pada ikan estuari telah dilaporkan pada ikan flounder Eropa (Platichthyes flesus) and flounder Jepang (Pleuronectes yokohamae) (Jobling, et al., 2002). Fenomena serupa ditemukan juga pada ikan mas (Cyprinus carpio) (Lavado, et al., 2004), bream (Abramis brama) (Vethaak, et al., 2005) dan white perch (Morone americana) (Kavanagh, et al., 2004).
Pada ikan roach, Rutilus rutilus, ekspose selama 300 hari pada air limbah konsentrasi 0, 15.2, 34.8, and 78.7% (yang diencerkan dengan air bersih) telah merangsang feminisasi pada individu jantan yang diukur dari induksi vitellogenin (Gambar 2) dan perubahan histologi gonad, menyebabkan perubahan yang signifikan pada perkembangan ginjal (Gambar 3), modulasi fungsi immum (jumlah total trombosit) dan menyebabkan kerusakan genotoksik (induksi mikronukleus dan kerusakan single-strand pada insang dan sel darah) (Liney, et al., 2006).
Pengaruh interseks akibat gangguan endokrin terhadap kemampuan fertilisasi (kualitas gamet) dipublikasikan oleh Jobling, et al. (2002). Pada ikan roach, persentase ikan yang mampu melakukan spermiasi dan fertilisasi menurun dengan adanya indikasi interseks yang lebih akut.

5. Efek Androgenik
Adanya gangguan endokrin yang mengarah pada maskulinisasi pada ikan liar berkaitan dengan buangan limbah dari industri pengolahan kayu. Pengaruh limbah kayu pada sistem sitokrom P450 pada ikan telah teridentifikasi dengan adanya interferensi pada sistem reproduksi yang meliputi depresi siskulasi hormon steroid, keterlambatan waktu pematangan, ukuran gonad yang lebih kecil, perubahan pada ekspresi karakter seks sekunder (Larsson, et al., 2002), munculnya tingkah laku dan warna tubuh seperti jantan pada ikan betina (Larsson, et al., 2006). Laporan awal mengenai fenomena ini dipublikasikan oleh Howell dan koleganya pada tahun 1980 yang mengidentifikasi adanya perkembangan pemanjangan sirip anal yang menirukan gonopodium jantan pada mosquitofish (Gambusia sp.) betina (Larsson, et al., 2006).
Maskulinisasi ikan yang ditemukan di aliran sungai yang menerima limbah kayu diperkuat oleh penelitian Larsson, et al. (2006). Hasil penelitian tersebut menunjukkan adanya multiple ligand terhadap reseptor androgen yang ditemukan pada limbah kayu, salah satunya adalah progesteron. Treatment biologi dapat mengurangi progesteron tersebut tetapi tidak mengurangi jumlah aktifitas pengikatan resepto androgen.
Selain pada masquitofish, penelitian mengenai pengaruh limbah kayu yang menyebabkan gangguan endokrin telah dipublikasikan terjadi pada ikan lake whitefish, (Coregonus clupeaformis), perch (Perca fluviatilis), largemouth bass(Micropterus salmoides), longear sunfish (Lepomis megalotis) (Fentress, et al., 2006), sidat (Anguilla rostrata), white suckers (Catosomus commersoni), fathead minnows (Pimephales promelas), viviparous eelpout (Zoarces viviparus) (Larsson, et al., 2002), guppy (Poecelia reticulata) (Larsson, et al., 2006) dan longnose sucker (Catostomus catostomus) (McMaster, et al., 2005). Sedangkan pada invertebrata dilaporkan pertama kali oleh Blaber tahun 1970 yang menemukan adanya struktur seperti penis disamping tentakel kanan dogwhelks (Nucella lapillus) (Sumpter, 2005).
Pada ikan longear sunfish (Lepomis megalotis) liar, adanya limbah dari olahan kayu tidak berpengaruh terhadap fisiologi reproduksi jantan tetapi dapat menekan tingkat testosteron dan vitellogenin pada ikan 1% dari aliran air (Gambar 6) (Fentress,³betina ketika limbah mencapai et al., 2006). Menurunnya tingkat vitellogenin berdampak pada lebih sedikitnya telur yang dikeluarkan induk betina ataupun memperpendek waktu pijah pada saat musim pemijahan. Menurut (Larsson, et al., 2002), terdapat hubungan yang jelas antara pergeseran seks rasio dengan ekspose terhadap limbah olahan kayu. Pada viviparous eelpout, terdapat embrio betina yang lebih sedikit dibandingkan dengan jantan pada daerah yang lebih dekat dengan sumber limbah kayu